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酶转化法提高黄芪甲苷的得率

黄芪是常用中药之一,具有补气、降压、强心、消炎和增强抗病毒能力等功效。研究发现,黄芪的主要有效成分黄芪皂苷中低糖基黄芪甲苷的药效高,关于其报道也相继出现,如毛羽等在6 种菌株中找出了能够更好水解黄芪总苷中含多糖基的黄芪皂苷的酶Absida.sp.39。肖丽丽等用硅胶柱层析法对黄芪皂苷生物转化产物进行分离纯化,经检测,转化物为黄芪甲苷。刘景利等利用AB-8大孔吸附树脂和D-280离子交换树脂富集黄芪甲苷,经薄层层析和高效液相色谱检测,证明了黄芪甲苷的相对含量明显提高。刘超等确定了微生物所产的黄芪皂苷酶将3个糖基黄芪皂苷转化为黄芪甲苷的酶性质。这些报道多侧重于黄芪皂苷酶性质的研究及黄芪皂苷生物转化物质的富集与纯化。对于黄芪甲苷,它的苷元结构与黄芪总皂苷中3个糖基皂苷是相同的,通过酶转化就可以得到。黄芪总皂苷中3个糖基皂苷的含量可达1O ~15 ,所以本实验主要通过对黄芪总皂苷提取纯化方法的研究,达到提高黄芪总皂苷中3个糖基皂苷的含量,再经酶转化,从而提高黄芪甲苷的得率。

1 材料和方法

1.1 材料与设备
黄芪,黄芪甲苷标准品,粗酶液;薄层层析板 Silica Gel 60F254,AB-8树脂,HP-20树脂。

1.2 方法

1.2.1 水提法提取黄芪总皂苷
精选黄芪根茎切片1 kg,提取过程分2次,第 1次用12倍黄芪质量的去离子水提取4 d;第2 次加水量为黄芪质量的1O倍,提取3 d。水提液 用滤纸过滤浓缩后,加入3倍浓缩液体积的95 乙醇,静置24 h,过滤去除沉淀,滤液浓缩,回收乙醇。

1.2.2 醇提法提取黄芪总皂苷
精选黄芪根茎切片1 kg,提取过程分2次,每次提取4 d。第1次乙醇量为黄芪质量的1O倍;
第2次乙醇量为黄芪质量的8倍。醇提液用滤纸过滤后减压浓缩,回收乙醇。

1.2。3 薄层层析检测
将薄层层析板在l1O℃ 烘箱活化3O~ 60 min,用刻度毛细管吸取标准品及样品,点样于薄层层析板上。每次的点样量依照样品浓度确定,每次点样后均须用电吹风吹干。将点好样品的薄层板放入层析缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0 cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封盖,待展开至规定距离后,取出,吹干溶剂,用显色剂显色。然后选择最佳的提取 工艺进行黄芪总皂苷的纯化。展开剂 (氯仿): (甲醇): (水)一8:3:0.5,显色剂为10 的 H2S0 水溶液。

1.2.4 A13-8大孔吸附树脂纯化黄芪总皂苷
将得到的黄芪总皂苷浓缩液用1/3体积的石 油醚萃取脱脂3次,每次萃取3 h,合并下层溶液。将得到的脱脂浓缩液上AB-8树脂柱(柱长 25 cm),反复上柱4"-5次,直至样品被充分吸附 为止。用5倍量的去离子水洗涤树脂柱,再用2 倍量的80 乙醇洗脱,收集洗脱液,旋转蒸发,干 燥得黄芪总皂苷粗品。

1.2.5 正丁醇萃取纯化黄芪总皂苷
将得到的黄芪总皂苷浓缩液用1/3体积的石 油醚萃取脱脂3次,每次萃取3 h,合并下层溶液, 再用1/3脱脂浓缩液体积的水饱和正丁醇重复萃 取3次,每次萃取2 h,合并正丁醇层,旋转蒸发,干燥得黄芪总皂苷粗品。

1.2.6 酶反应制备黄芪甲苷
称取以上两种方法纯化得到的黄芪总皂苷各5 g,配制成20 mg/mL 底物溶液(200 mL0.02 mol/L pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液加 95 9,6乙醇50 mL),与250 mL酶液(0.02mol/L pH 5.O的NaAc—HAc缓冲液体系)等体积混合, 在RAT玻璃反应釜中30℃反应24 h。

2 结果与讨论

2.1 水提法与醇提法对黄芪总皂苷提取效果的影响
分别采用水提法与醇提法提取黄芪总皂苷, 薄层层析检测谱图见图1。通过对图1的分析可知,在两种提取方法中,醇提法的皂苷含量要高于水提法中的皂苷含量,而水提法的粗品含量要明显的高于醇提法,这主要是因为水提过程中,溶进了较多的亲水性物质,但是醇提法中这样的物质就少一些,有利于黄芪总皂苷的进一步纯化。因此采用醇提法来制备黄芪总皂苷。

2.2 AB-8大孔吸附树腊法与正丁醇萃取法对黄芪总皂苷纯化效果的影响
经醇提法得到的2.5 L浓缩液上AB-8树脂 柱,充分吸附后,进行洗脱,收集洗脱液,旋转蒸 发,干燥得黄芪皂苷粗品11 g。薄层层析检测谱 图如图2中1所示,经AB-8处理,水洗糖使黄芪 总皂苷中含糖量减少,但在水洗糖的同时也洗掉 3个糖基皂苷,损失大,总皂苷得率只有1.1 。 用正丁醇萃取法处理醇提法得到的2.5 L浓缩液 后,蒸干得到的黄芪总皂苷粗品为40 g,得率为 4.O 。薄层层析检测如图2中2所示。正丁醇 不但可以萃取浓缩液中大部分的3个糖基皂苷, 使黄芪总皂苷提取率得以提高,也可以有效除去 小分子物质。但是,其总皂苷中含糖较高,精心用 HP-20大孔树脂除糖,得到粗品的64 9,6除糖总 皂苷。
从图2中可以看到,醇提法制备的黄芪总皂 苷经AB-8大孔吸附树脂纯化后,3个糖基皂苷的 量有明显的减少,这可能是因为AB一8大孔吸附 树脂对3个糖基皂苷的吸附力较低,从而造成了 在水洗糖的过程中对其损失大。正丁醇萃取法可 以有效地萃取黄芪总皂苷中的3个糖基皂苷,使更多的3个糖基皂苷通过酶转化变成黄芪甲苷,从而提高黄芪甲苷的得率。

2.3 酶反应制备黄芪甲苷
酶反应24 h之后加入1 500 mL 95 的乙 醇,静置4 h后在8 000 r/min下离心8 min,取上 清液。上清液进行减压浓缩、干燥,得到的物质即 为黄芪皂苷酶解产物。AB-8大孔吸附树脂纯化 得到的黄芪总皂苷经酶处理,薄层层析谱图如图 3中3所示,得到酶解产物3.8g,产物得率为 76% ,其中黄芪甲苷的得率为4.0 左右。正丁 醇萃取纯化得到的黄芪总皂苷经酶处理,薄层层 析谱图如图3中4所示,得到酶解产物4.1 g,产 物得率为82 ,其中黄芪甲苷的得率为20 左 右,比反应前提高了l5 。
由图3分析可知,AB-8大孔吸附树脂纯化得 到的黄芪总皂苷经酶转化后,黄芪甲苷的得率不高,这是因为在纯化过程中对3个糖基皂苷的损失大,以及一些没洗掉的小分子物质所造成的。 而通过正丁醇萃取法纯化得到的黄芪总皂苷经酶 转化后,由于对3个糖基皂苷的萃取效果好,使得可用于转变成黄芪甲苷的3个糖基皂苷的含量升高,其转化率又可以达到90% ,所以黄芪甲苷的得率提高为20% ,比反应前提高了约15 。

3 结论

通过对水提法和醇提法提取黄芪总皂苷的比较研究,最终采用醇提法来提取黄芪总皂苷。在进行纯化过程中,比较了AB-8大孔吸附树脂法和正丁醇萃取法,由薄层层析检测谱图可以看出,正丁醇萃取法要明显优于AB-8大孔吸附树脂法,其原因是正丁醇能够很好地从溶液中萃取出 3个糖基皂苷,也可以有效地除去小分子物质。 纯化后的黄芪总皂苷经酶转化生成黄芪甲苷,可提高黄芪甲苷的得率,从而提高黄芪总皂苷的药用价值

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