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公司新闻


酶转化法提高黄芪甲苷的得率

黄芪是常用中药之一,具有补气、降压、强心、消炎和增强抗病毒能力等功效。研究发现, 黄芪的主要有效成分黄芪皂苷中低糖基黄芪甲苷的药效高,关于其报道也相继出现,如毛羽 等在6 种菌株中找出了能够更好水解黄芪总苷中含多糖基的黄芪皂苷的酶Absida.sp.39。 肖丽丽等用硅胶柱层析法对黄芪皂苷生物转化产物进行分离纯化,经检测,转化物为黄芪甲 苷。刘景利等利用AB-8大孔吸附树脂和D-280离子交换树脂富集黄芪甲苷,经薄层层析和 高效液相色谱检测,证明了黄芪甲苷的相对含量明显提高。刘超等确定了微生物所产的黄芪 皂苷酶将3个糖基黄芪皂苷转化为黄芪甲苷的酶性质。这些报道多侧重于黄芪皂苷酶性质的 研究及黄芪皂苷生物转化物质的富集与纯化。对于黄芪甲苷,它的苷元结构与黄芪总皂苷中 3个糖基皂苷是相同的,通过酶转化就可以得到。黄芪总皂苷中3个糖基皂苷的含量可达 1O ~15 ,所以本实验主要通过对黄芪总皂苷提取纯化方法的研究,达到提高黄芪总皂苷 中3个糖基皂苷的含量,再经酶转化,从而提高黄芪甲苷的得率。

1 材料和方法

1.1 材料与设备
黄芪,黄芪甲苷标准品,粗酶液;薄层层析板 Silica Gel 60F254,AB-8树脂,HP-20树脂。

1.2 方法

1.2.1 水提法提取黄芪总皂苷
精选黄芪根茎切片1 kg,提取过程分2次,第 1次用12倍黄芪质量的去离子水提取4 d; 第2 次加水量为黄芪质量的1O倍,提取3 d。水提液 用滤纸过滤浓缩后,加入3倍浓缩 液体积的95 乙醇,静置24 h,过滤去除沉淀,滤液浓缩,回收乙醇。

1.2.2 醇提法提取黄芪总皂苷
精选黄芪根茎切片1 kg,提取过程分2次,每次提取4 d。第1次乙醇量为黄芪质量的1O 倍;
第2次乙醇量为黄芪质量的8倍。醇提液用滤纸过滤后减压浓缩,回收乙醇。

1.2。3 薄层层析检测
将薄层层析板在l1O℃ 烘箱活化3O~ 60 min,用刻度毛细管吸取标准品及样品,点样于 薄层层析板上。每次的点样量依照样品浓度确定,每次点样后均须用电吹风吹干。将点好样 品的薄层板放入层析缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0 cm(切 勿将样点浸入展开剂中),密封盖,待展开至规定距离后,取出,吹干溶剂,用显色剂显色。 然后选择最佳的提取 工艺进行黄芪总皂苷的纯化。展开剂 (氯仿): (甲醇): (水)一8:3: 0.5,显色剂为10 的 H2S0 水溶液。

1.2.4 A13-8大孔吸附树脂纯化黄芪总皂苷
将得到的黄芪总皂苷浓缩液用1/3体积的石 油醚萃取脱脂3次,每次萃取3 h,合并下层 溶液。将得到的脱脂浓缩液上AB-8树脂柱(柱长 25 cm),反复上柱4"-5次,直至样品被充 分吸附 为止。用5倍量的去离子水洗涤树脂柱,再用2 倍量的80 乙醇洗脱,收集洗脱液, 旋转蒸发,干 燥得黄芪总皂苷粗品。

1.2.5 正丁醇萃取纯化黄芪总皂苷
将得到的黄芪总皂苷浓缩液用1/3体积的石 油醚萃取脱脂3次,每次萃取3 h,合并下层 溶液, 再用1/3脱脂浓缩液体积的水饱和正丁醇重复萃 取3次,每次萃取2 h,合并正 丁醇层,旋转蒸发,干燥得黄芪总皂苷粗品。

1.2.6 酶反应制备黄芪甲苷
称取以上两种方法纯化得到的黄芪总皂苷各5 g,配制成20 mg/mL 底物溶液(200 mL 0.02 mol/L pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液加 95 9,6乙醇50 mL),与250 mL酶液(0.02 mol/L pH 5.O的NaAc—HAc缓冲液体系)等体积混合, 在RAT玻璃反应釜中30℃反 应24 h。

2 结果与讨论

2.1 水提法与醇提法对黄芪总皂苷提取效果的影响
分别采用水提法与醇提法提取黄芪总皂苷, 薄层层析检测谱图见图1。通过对图1的分析 可知,在两种提取方法中,醇提法的皂苷含量要高于水提法中的皂苷含量,而水提法的粗品 含量要明显的高于醇提法,这主要是因为水提过程中,溶进了较多的亲水性物质,但是醇提 法中这样的物质就少一些,有利于黄芪总皂苷的进一步纯化。因此采用醇提法来制备黄芪总 皂苷。

2.2 AB-8大孔吸附树腊法与正丁醇萃取法对黄芪总皂苷纯化效果的影响
经醇提法得到的2.5 L浓缩液上AB-8树脂 柱,充分吸附后,进行洗脱,收集洗脱液,旋 转蒸 发,干燥得黄芪皂苷粗品11 g。薄层层析检测谱 图如图2中1所示,经AB-8处理, 水洗糖使黄芪 总皂苷中含糖量减少,但在水洗糖的同时也洗掉 3个糖基皂苷,损失大,总 皂苷得率只有1.1 。 用正丁醇萃取法处理醇提法得到的2.5 L浓缩液 后,蒸干得到的 黄芪总皂苷粗品为40 g,得率为 4.O 。薄层层析检测如图2中2所示。正丁醇 不但可以 萃取浓缩液中大部分的3个糖基皂苷, 使黄芪总皂苷提取率得以提高,也可以有效除去 小 分子物质。但是,其总皂苷中含糖较高,精心用 HP-20大孔树脂除糖,得到粗品的64 9,6 除糖总 皂苷。
从图2中可以看到,醇提法制备的黄芪总皂 苷经AB-8大孔吸附树脂纯化后,3个糖基皂苷 的 量有明显的减少,这可能是因为AB一8大孔吸附 树脂对3个糖基皂苷的吸附力较低, 从而造成了 在水洗糖的过程中对其损失大。正丁醇萃取法可 以有效地萃取黄芪总皂苷中的 3个糖基皂苷,使更多的3个糖基皂苷通过酶转化变成黄芪甲苷,从而提高黄芪甲苷的得率。

2.3 酶反应制备黄芪甲苷
酶反应24 h之后加入1 500 mL 95 的乙 醇,静置4 h后在8 000 r/min下离心8 min,取 上 清液。上清液进行减压浓缩、干燥,得到的物质即 为黄芪皂苷酶解产物。AB-8大孔吸 附树脂纯化 得到的黄芪总皂苷经酶处理,薄层层析谱图如图 3中3所示,得到酶解产物3.8 g,产物得率为 76% ,其中黄芪甲苷的得率为4.0 左右。正丁 醇萃取纯化得到的黄芪总 皂苷经酶处理,薄层层 析谱图如图3中4所示,得到酶解产物4.1 g,产 物得率为82 , 其中黄芪甲苷的得率为20 左 右,比反应前提高了l5 。
由图3分析可知,AB-8大孔吸附树脂纯化得 到的黄芪总皂苷经酶转化后,黄芪甲苷的得 率不高,这是因为在纯化过程中对3个糖基皂苷的损失大,以及一些没洗掉的小分子物质所 造成的。 而通过正丁醇萃取法纯化得到的黄芪总皂苷经酶 转化后,由于对3个糖基皂苷的 萃取效果好,使得可用于转变成黄芪甲苷的3个糖基皂苷的含量升高,其转化率又可以达到 90% ,所以黄芪甲苷的得率提高为20% ,比反应前提高了约15 。

3 结论

通过对水提法和醇提法提取黄芪总皂苷的比较研究,最终采用醇提法来提取黄芪总皂苷。 在进行纯化过程中,比较了AB-8大孔吸附树脂法和正丁醇萃取法,由薄层层析检测谱图可 以看出,正丁醇萃取法要明显优于AB-8大孔吸附树脂法,其原因是正丁醇能够很好地从溶 液中萃取出 3个糖基皂苷,也可以有效地除去小分子物质。 纯化后的黄芪总皂苷经酶转化 生成黄芪甲苷,可提高黄芪甲苷的得率,从而提高黄芪总皂苷的药用价值