巨噬细胞移动抑制因子在病毒性心肌炎中的作用
巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)由活化T细胞产生，因其可以抑制离体巨噬细胞迁移和在皮肤迟发性超敏反应中促进巨噬细胞的聚集而得名。MIF是一种重要的前炎症细胞因子，参与急性胰腺炎、溃疡性结肠炎、肾炎等多种炎症性疾病的发生和发展，然而 MIF在病毒性心肌炎(viral myocarditis)发病过程中的作用鲜有报道。黄芪甲苷为一种黄芪有效成分皂苷类的单体成分。本课题组前期研究表明，黄芪甲苷对Balb/c小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)性心肌炎有明显的治疗作用 ，但其作用机理尚未完全阐明。本研究通过观察MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中的表达，以及不同剂量黄芪甲苷干预后的改变，从而探讨MIF在病毒性心肌炎发病机制中的作用及黄芪甲苷的干预效果，为临床治疗病毒性心肌炎提供理论基础和实验依据。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 药物、试剂和仪器 黄芪甲苷(批号0781-9706)由中国药品生物制品检定所提供，为纯白色干粉剂，不溶于水，用助溶剂羧甲基纤维素钠制成均匀悬液，浓度分别为1% 、9% 。兔抗鼠的MIF多克隆抗体购于Santa Cruz公司。Trizol试剂、Super script Ⅱ逆转录试剂盒及PCR试剂盒购于Invitrogen公司。二氨基联苯胺(DAB，武汉博士德公司)。 PIPS-2020图像分析仪(重庆天海公司)；3K30型离心机(美国Sigma公司)。
1．1．2 动物 雄性纯种Balb/c小鼠(批号SCYK 沪2002-0002)，4周龄，体重12～16 g，由复旦大学 动物实验科学部提供，饲养于SPF级环境中。
1．1．3 病毒 柯萨奇病毒B3(CVB3)，Nancy株， 由复旦大学附属中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供，在Hela细胞中传代，冻融离心3次，分装上清液，并在Hela细胞测50%组织感染率 (TCID50)为1×107 ，-70℃保存备用。实验用量为 1× 102 TCID50。
1．2 方法
1．2．1 动物模型构建和给药方法 将55只Balb/c小鼠随机分为4组：正常对照组(A组， n=10)、模型对照组(B组，n=15)、低剂量干预组(C组， n=15) 和高剂量干预组(D组，n=15)。A组小鼠仅腹腔接 种0.1mI 病毒培养液，其余3组每只鼠经腹腔接种0.1mL内含l×102 TCID50CVB3的病毒液建立病毒性心肌炎实验模型。A、B组于接种当日开始用羧甲基纤维素钠溶液0.1 mL灌胃，C、D组分别 以1%、9% 黄芪甲苷0.1 mI 灌胃，均为1次/d，连 续2周。观察15 d，记录各组每天存活小鼠数。第 15天无痛处死各组存活小鼠，留取心脏，将心脏沿左室中线切为两半，一半用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋后，作病理组织学和免疫组化检测；另一半迅速放入液氮，再转移至-70℃冰箱保存，用于提取总RNA 。
1．2．2 MIF蛋白质的免疫组化检测 按常规ABC 法进行免疫组化检测，DAB显色，光镜下观察结果，细胞内呈颗粒状或均质状棕色反应为阳性。本实验用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为空白对照。在 PIPS-2020图象分析仪上，每个切片随机取5个高倍视野，测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，计算阳性信号指数，作为MIF表达水平。阳性信号指数=阳性信号面积×阳性信号平均灰度值/测定面积×100。
1．2．3 MIF mRNA 的RT-PCR检测 采用Trizol 试剂抽提心肌组织总RNA，获得的RNA按Super script Ⅱ逆转录试剂盒说明合成cDNA。按PCR试剂盒说明进行DNA扩增，MIF引物序列：上游5'-ATGGCACGAATGAGGAAGAG-3'，下游： 5'-GAAAAAGCCTCCCCTTCTTG-3'，扩增产物长度 196 bp。GAPDH 引物序列：上游：5'-AG GAGCGAGACCCCACTAACAT-3'，下游：5'-GT GATGGCATGGACTGTGGT -3'，扩增产物长度 313 bp。PCR反应条件：95℃预变性3 min，然后 94℃ 30 S、55℃ 1 min、72℃ 1 min，反应35个循环后72℃延伸10 min。取上述PCR产物5μL，在 含1.5 溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离后，扫描仪扫描，用Total lab分析软件进行条带扫描分析，计算MIF PCR产物吸光度与GAPDH 产物吸光度之比值，作为MIF mRNA相对含量。
1．2．4 病理学检查常规苏木素-伊红(HE)染色， 200倍光镜下观察心肌病理改变，并根据Kishimoto方法计算心肌病变(炎性浸润及坏死)积分。即每张切片随机取5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比。无病变计0分，病变面积< 25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，>75%计4分。
1．3 统计学处理 用SPSS11.0软件进行统计分析，数据采用X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，百分率的比较采用X2检验。
2 结 果
2．1 各组小鼠死亡率 接种后15 d，A组无小鼠死亡，B、C、D 组死亡率分别为46.7% (7/15)、 40.0% (6/l5)、13.3% (2/15)，D组死亡率较B、C 组明显降低(P<0.05)，但c组与B组比较差异无显著性(P>0.05)。
2．2 心肌病理组织学变化 A组心肌排列规则，胞浆着色均匀，无炎性细胞浸润。B组可见病变的心肌细胞坏死崩解，胞核和细胞轮廓消失，周围出现大量的炎症细胞浸润，间质内可见较多的胶原纤维。C组和D组上述病变减轻，尤以D组改善最为显著，仅见少量的坏死灶和炎性细胞浸润。D组心肌病理积分明显低于B、C两组(P＜0.01)，而C组与B组比较变化不明显（P＞0.05），见图1、表1。
图1 各组小鼠心肌病理学图片(HE染色,×200)
2．3 MIF mRNA表达琼脂糖凝胶电泳结果进行半定量分析显示，B组心肌MIF mRNA表达量明 显高于A组(P<0.01)，表明MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌表达显著升高。黄芪甲苷干预后，D组明显降低，与B组和C组比较，差异有显著性(P< 0.01)，而B、C 两组比较差异无显著性．见表1、 图2。
表1 各组小鼠MIFmRNA和蛋白质表达水平比较
**P<0.01，与正常对照组比较；△△P<0.01，与模型对照组比较；▲▲P<0.01，与低剂量干预组比较
图2 各组小鼠心肌MIF mRNA表达
1：正常对照组；2：模型对照组；3：低剂量干预组；4：高剂量干预组
2．4 MIF蛋白质表达 A组心肌细胞胞浆内可见散在着色较浅的棕黄色阳性颗粒，而B组阳性颗粒数目显著增多，着色更深，尤以病灶部位明显(图3)。C组和D组小鼠经黄芪甲苷干预治疗后，阳性颗粒数目减少，MIF免疫组化阳性信号指数的动态变化与MIF mRNA表达水平的变化相似，见表1。
图3 各组小鼠心肌MIF蛋白免疫组织化学染色图片(DAB染色,×200)
A：正常对照组；B：模型对照组；C：低剂量干预组；D：高剂量干预组
3 讨 论
MIF作为一种前炎症细胞因子，在炎症反应和免疫调节中发挥重要作用。当机体受到微生物感染或发生应激反应时，T细胞、B细胞、垂体前叶细胞及单核巨噬细胞等免疫细咆释放大量MIF。MIF不仅有抑制巨噬细胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，还有促进巨噬细胞在炎症局部浸润、增生、激活， 以及通过调节细胞信号转导，促进某些细胞因子的表达，分泌细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ等,等，同时使NO释放增加和磷脂酶A。的表达 增强，极大地促进炎症反应。本研究发现，模型对照组心肌MIF mRNA和蛋白质表达水平显著高于正常对照组，提示MIF在病毒性心肌炎发生、发展中起重要作用。Matsui等发现在实验性自身免疫性心肌炎中，心肌组织中MIF mRNA 和蛋白质水平明显增加，此外，血清MIF浓度也显著升高。而通过MIF中和抗体阻断MIF的表达，则可以明显减轻心肌的病变程度，并降低心肌中IL-1β和TNF-α的表达。同样，Shioji等在研究自身免疫性巨细胞性心肌炎时发现，当注射MIF中和抗体后，心肌炎症病变显著减轻。上述研究表明，MIF 可能与病毒性心肌炎的形成有密切关系，有望成为治疗病毒性心肌炎的一种关键靶分子。
黄芪对病毒性心肌炎有良好的治疗作用，具有抑制病毒复制，改善心功能，减轻心肌病理改变等疗效。黄芪甲苷为我国拥有自主知识产权的一种黄芪皂苷类单体成分，为黄芪制剂中的主要有效成分，黄芪制剂的质量控制标准都是以黄芪皂苷的含量为指标。本课题组前期研究证实，黄芪甲苷可以明显提高感染CVB3小鼠的生存率，改善心肌组织病理改变，减轻炎症细胞浸润及坏死病灶，降低心肌组织中病毒滴度及病毒RNA 的复制水平，对接种CVB3小鼠的病毒性心肌炎疗效确切，而且毒性很低，但对其作用机制不完全清楚。本研究中，病毒性心肌炎小鼠给予高剂量黄芪甲苷干预治疗后，MIF 表达显著下调，心肌损害减轻，小鼠死亡率降低，而低剂量黄芪甲苷干预则无此作用，提示黄芪甲苷能降低病毒性心肌炎小鼠的死亡率，减轻心肌损害，对病毒性心肌炎有良好的治疗作用，并且呈现出剂量依赖性，其机制可能与抑制MIF表达，减轻MIF介导的心肌炎症反应有关。总之，病毒性心肌炎小鼠 急性期存在MIF表达上调，黄芪甲苷能显著下调 MIF表达，减轻心肌炎症反应，改善预后，这为黄芪的进一步开发应用打下基础。